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菌种的培养
在柠檬酸的工业生产中都采用微生物发酵法，而有的只有几种曲霉菌和酵母菌，其中黑曲霉菌是工业中具有竞争力的菌种，酵母中竞争力强的有解脂假丝酵母和季也蒙赤酵母等。
黑曲霉是在琼脂上培养的，在琼脂上成局限菌落，在室温下培养10~14天，成为丰富密集的孢子梗，菌落为黑色，有时也为深褐黑色。考虑到柠檬酸生产菌应具有产酸能力强和耐柠檬酸浓度高的特点，可采用酸性滤纸法、变色圈法和单孢子移植法将黑曲霉分离出来，以避免其他杂菌干扰，使其成为生产柠檬酸用黑曲霉。
酵母的培养可用于柠檬酸生产的酵母有解脂假丝酵母和季也蒙假丝酵母2种。前者有很强的分解脂肪的能力，较好的炭源是正烷烃。后者可由烷烃发酵生成柠檬酸，也可由糖类发酵生成柠檬酸，酵母发酵pH值为3.5~4.0。

柠檬酸是代谢过程中的中间产物。在发酵过程中，当微生物体内的酸水合酶和异柠檬酸脱氢酶活性很低、而柠檬酸合成酶活性很高时，才有利于柠檬酸的大量积累。
发酵工艺分表面发酵和固体发酵，按不同工艺制备不同原料的培养基，然后进行蒸料。蒸料的目的是将淀粉糊化，并进行灭菌。蒸料时要使物料受热均匀，蒸汽通畅，边蒸边加料，把料加在冒汽的地方，逐层加入。蒸好的物料要扬散摊凉，当温度降至37℃以下，即可补水接种，装盘发酵，发酵终点以酸度来决定，定期测定酸度，在酸度时出料，以免柠檬酸被分解。

柠檬酸钙用酸解，按溶液中柠檬酸含量确定的用量，一般过量不超过0.2%。酸解后，酸液进行过滤。柠檬酸溶液的净化通过吸附脱色和离子交换除去溶液中的色素、胶体和铁离子、钙离子、铜离子、镁离子等金属阳离子以及根离子等阴离子杂质。