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牵牛子染料法PCR鉴定试剂盒

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产品名称:牵牛子染料法PCR鉴定试剂盒

英文名称:Semen pharbitidis

产品货号:LZ-P2474

分类:PCR检测试剂盒

储存条件:-20℃避光保存,避免反复冻融。

运输:低温、避光,快递免费送货上门。

PCR检测试剂盒有效期一般为1年,这是指在适当的储存温度下。核酸扩增部分的试剂一般要贮存于-20℃下,产物检测部分试剂则贮存于2-8℃。尽量避免反复冻融。北京

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PCR反应的特异性决定因素为:

   ①引物与模板DNA特异正确的结合;

   ②碱基配对原则;

   ③Taq DNA聚合酶合成反应的忠实性;

   ④靶基因的特异性与保守性。

其中引物与模板的正确结合是关键。引物与模板的结合及引物链的延伸是遵循碱基配对原则的。聚合酶合成反应的忠实性及Taq DNA聚合酶耐高温性,使反应中模板与引物的结合(复性)可以在较高的温度下进行,结合的特异性大大增加,被扩增的靶基因片段也就能保持很高的正确度。再通过选择特异性和保守性高的靶基因区,其特异性程度就更高。

(2) 灵敏度高

PCR产物的生成量是以指数方式增加的,能将皮克(pg=10-12g)量级的起始待测模板扩增到微克(ug=10-6g)水平。能从100万个细胞中检出一个靶细胞;在病毒的检测中,PCR的灵敏度可达3个RFU(空斑形成单位);在细菌学中小检出率为3个细菌。

(3) 简便、快速

PCR反应用耐高温的Taq DNA聚合酶,一次性地将反应液加好后,即在DNA扩增液和水浴锅上进行变性-退火-延伸反应,一般在2~4 小时完成扩增反应。扩增产物一般用电泳分析,不一定要用同位素,无放射性污染、易推广。

(4) 对标本的纯度要求低

不需要分离病毒或细菌及培养细胞,DNA 粗制品及总RNA均可作为扩增模板。可直接用临床标本如血液、体腔液、洗嗽液、毛发、细胞、活PCR技术概论。


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【结果分析条件设定】

u 基线(Baseline)设定:应选择该次实验指数扩增前所有样本荧光信号比较稳定的一段区域(所有样本荧光信号无较大波动),起始点(Start)应避开荧光采集起始阶段的信号波动,终止点(End)应比早出现指数扩增的样本Ct值减少1~3个循环,建议基线设为6~15。

u 阈值(Threshold)设定:将阈值线设定在刚好超过正常阴性质控品扩增曲线的高点。

【质控标准】

1. 阴性质控品的检测结果应为阴性,无指数扩增期,Ct=40或无Ct;

2.   阳性质控品的检测结果应为阳性,有明显的指数扩增期,Ct值应小于等于35;

3.   以上要求需在一次实验中同时满足,否则该次实验视为无效。

【结果判断】

1. 牵牛子染料法PCR 阳性:有明显的指数扩增期,且Ct<38;

2.可疑:有明显的指数扩增期,且38≤Ct<40,此时样本为可疑样本;对于可疑样本建议复核一次,若复核结果Ct<40且有指数扩增期,则判定为阳性,否则判定为阴性;

3.   阴性:无指数扩增期,Ct=40或无Ct值均判定为阴性样本。

PCR检测步骤:

1、牵牛子染料法试剂盒样品处理

1)按照GB 4789.10-2016(或SN/T 1870-2016),取样品25g(mL),加入到含有225mL 7.5% NaCl肉汤的无菌容器中均质,调节pH至6.8±0.2。

2)36±1℃培养18-24h。

注:也可参考其他地方标准进行样品的前处理。

2、核酸提取

1)取40μL增菌液于裂解液管中,98℃或沸水浴10min。

2)冷却至室温,吸取上清备用或者置于-20℃保存。

3、反应体系配置

从试剂盒中取出SA预混液,充分融化,短暂离心,然后将阴性对照、样品的DNA提取液、阳性对照各取5μL分别加入PCR管中,盖好管盖,短暂离心,立即进行PCR扩增反应。

4、PCR扩增

PCR管置于PCR仪上,推荐反应程序设定如下:反应体系为25μL,在第二步每个循环60℃时检测荧光信号,检测通道选择FAM。

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