干货分享Transwell侵袭实验

实验步骤
1. 实验准备
提前12 h将Matrigel放到4℃融化，将实验用到的枪头、EP管等材料提前放到-20℃预冷；实验前准备冰盒，整个实验操作过程置于冰上进行；
2. 包被基底膜
在冰上将Matrigel胶用无血清的细胞培养基进行稀释，混匀后加入小室中，注意动作轻柔，不要产生气泡，将小室放入CO2培养箱中孵育2h备用；
3. 水化基底膜
将孵育完成的小室中上室多余的液体小心吸掉，每孔中加入100 μL无血清培养基，在培养箱中放置30 min。
4. 接种细胞
a. 将状态良好的细胞进行消化，离心，用PBS洗1-2遍，用无血清培养基重悬细胞，调整细胞密度至1-10×105/ml（需要做预实验确定具体的细胞密度）；
b. 在下室中加入500μL的含10%FBS的培养基，将小室小心放入24孔板内，在上室中加入细胞悬液100 μL-200 μL，放入培养箱中（需要做预实验确定具体的培养时间）。
5. 固定染色、拍照及计数
a. 到时间点后将小室取出，用PBS清洗小室，用棉签轻柔擦去上室细胞和Matrigel后，用4%多聚甲醛固定或甲chun20 min，将小室适当风干，用0.1%结晶紫染色30 min，PBS清洗3遍，于37℃干燥。
b. 将小室置于显微镜下，随机选取5个视野，拍照并计数。
三、注意事项
1. Matrigel使用说明
Matrigel应避免反复冻融，分装时将整瓶Matrigel埋没在碎冰盒中，再将冰盒置于4℃冰箱中，建议放在冰箱靠后的位置，放置过夜，避免使用冰箱门进行解冻，因为其内装物的温度在反复打开时会迅速上升，导致材料过早凝胶化。分装后置于-20℃保存，长期保存可放于-80℃冰箱中；
2. 如何尽量避免增殖对结果的影响
如果在侵袭实验期间发生了大量的增殖，那么计算出的侵袭数据将受到影响。因此，侵袭实验时间越短，增殖对数据的影响就越小。当然，实验中的肿瘤细胞很可能在48或72小时内就会增殖，但如果每个治疗组的增殖量是相似的，允许直接比较治疗组之间的相对侵袭数据；
3. 小室的重复使用
很多实验室会将小室进行重复利用，我们需要在用棉签擦拭时避免用力，避免损伤小室膜，重复利用前应在镜下观察小室膜是否有裂缝。