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线粒体苹果酸脱氢酶(MDHm)试剂盒微量法

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线粒体苹果酸脱氢酶(MDHm)试剂盒微量法说明书

微量法 100管/96样    

正式测定前务必取 2-3 个预期差异较大的样本做预测定

商品属性:

产品名称:线粒体苹果酸脱氢酶(MDHm)试剂盒微量法

货号:LZ-S01148

规格 : 100管/96样

测试方法:微量法

产品分类:三羧酸循环系列

发货地:上海

测定意义:

MDH (EC 1.1.1.37)广泛存在于动物、植物、微生物和培养细胞中,线粒体中MDH是TCA循环的关键酶之一,催化苹果酸形成草酰乙酸;相反,胞浆中MDH催化草酰乙酸形成苹果酸。草酰乙酸是重要的中间产物, 连接多条重要的代谢途径。因此,MDH在细胞多种生理活动中扮演着重要的角色,包括线粒体的能量代谢、 苹果酸-天冬氨酸穿梭系统、活性氧代谢和抗病性等。根据不同的辅酶特异性,MDH分为NAD-依赖的MDH和NADP-依赖的MDH,细菌中通常只含有NAD-MDH,在真核细胞中,NAD-MDH分布于细胞质和线粒体中。

测定原理:

MDHm催化NADH还原草酰乙酸生成苹果酸,导致340nm处光吸收下降。

需自备的仪器和用品:

紫外分光光度计/酶标仪、台式离心机、水浴锅、可调式移液器、微量石英比色皿/96孔板和蒸馏水。

试剂的组成和配制:

试剂一:100mL×1 瓶,-20℃保存;

试剂二:20mL×1 瓶,-20℃保存;

试剂三:1.5mL×1 支,-20℃保存;

试剂四、液体 20 mL×1 瓶,在 4℃保存;

试剂五、粉剂×1 瓶,-20℃保存;

样本测定的准备:

组织、细菌或细胞中胞浆蛋白与线粒体蛋白的分离:

1、 称取约 0.1g 组织或收集 500 万细胞,加入 1mL 试剂一和 10uL 试剂三,用冰浴匀浆器或研钵匀浆。

2、 将匀浆液于 600g,4℃离心 5min。

3、 弃沉淀,将上清液移至另一离心管中,11000g,4℃离心 10min。

4、 上清液即胞浆提取物,可用于测定从线粒体泄漏的 MDH(此步可选做)。

5、 在步骤④的沉淀中加入 200uL 试剂二和 2uL 试剂三,超声波破碎(冰浴,功率 20%或200W,超声 3 秒,间隔 10 秒,重复 30 次),用于 MDHm 活性测定。

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生化检测试剂盒操作步骤:

一、‌准备工具和环境‌:确保操作台面干净、整洁,这是进行科学实验的步。

‌二、‌仔细阅读说明书‌:这是使用试剂盒的基础,说明书包含了所有必要的信息和操作指南。

三、样本采集‌:按照说明书的指导,正确采集样本。不同类型的检测可能需要不同类型的样本,如血液、唾液或鼻涕等。杭州

‌四、样本混合‌:将样本与试剂小心混合,注意轻柔操作,避免产生泡沫,以确保检测的准确性。

‌五、‌等待反应‌:混合后,耐心等待试剂盒的反应,这个时间可以用来进行其他活动,但不要着急,因为好的结果值得等待。

六、结果判读‌:时间到后,仔细判读结果。试剂盒通常会有明确的指示,告诉你如何根据显示的线条或颜色来判断结果。

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注意事项:

①加入试剂的顺序应一致,以所有反应板孔温育的时间一样。

②使用干净的塑料容器配置洗涤液。

③按照说明书中标明的时间、加液的量及顺序进行温育操作。

④底物A应挥发,避免长时间打开盖子。底物B对光敏感,避免长时间暴露于光下。避免用手接触,有毒。实验完成后应立即读取OD值。

⑤洗涤酶标板时应充分拍干,不要将吸水纸直接放入酶标反应孔中吸水。

⑥使用一次性的吸头以免交叉污染,吸取终止液和底物A、B液时,避免使用带金属部分的加样器 。

⑦实验中不用的板条应立即放回包装袋中,密封保存,以免变质。

⑧试剂应按标签说明书储存,使用前恢复到室温。稀稀过后的标准品应丢弃,不可保存。

⑨不用的其它试剂应包装好或盖好。

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