线粒体活性氧产生速率（ROS）试剂盒荧光法

线粒体活性氧产生速率（ROS）试剂盒荧光法说明书

荧光法 100管/96样   

正式测定前务必取 2-3 个预期差异较大的样本做预测定

商品属性：

产品

发货地：上海

测定意义:

活性氧(Reactive oxygen species, ROS)包括超氧自由基、过氧化氢、及其下游产物过氧化物和羟化物等，研究表明，机体95％以上的活性氧（ROS）都来自于线粒体，其失衡所致的氧化应激与细胞生长增殖、发育分化、衰老和凋亡以及许多生理和病理过程有关。
正常情况下，细胞内抗氧化防御系统与氧自由基处于平衡状态，细胞内活性氧（ROS）水平维持在较低的生理范围；在病理情况下，细胞内抗氧化系统与氧自由基的平衡被打破，细胞内活性氧水平过多，就可破坏线粒体酶类、脂类和核酸，使机体出现氧化应激，同时，活性氧还可攻击线粒体DNA产生氧化损伤，导致线粒体ATP合成减少、线粒体膜电位破坏等结构和功能变化。
因此，通过检测活性氧的变化来判断线粒体的功能是否正常具有重要意义。

测定原理:

荧光探针-还原型二氯荧光素 (2', 7'-dichlorodihy drofluorescin diacetate, DCFH-DA)可扩散通过线粒体膜，在线粒体内被酯酶水解，形成无荧光的DCFH，DCFH迅速与ROS反应生成荧光物—氧化型二氯荧光素(2', 7'-dichlo rofluorescin, DCF)。 根据上述原理设计了利用荧光法直接定量检测线粒体ROS产生速率的方法。将荧光强度随时间变化的数据点拟合，线性回归直线斜率与ROS产生的速率呈正比。
需自备的仪器和用品：
多功能酶标仪、恒温培养箱、分析天平、可调式移液器、冰、蒸馏水。

试剂的组成和配制:

试剂一：液体 120 mL×1 瓶, 4℃保存；

试剂二：液体 50 mL×1 瓶，4℃保存；

试剂三：液体 1.5 mL×1 瓶,-20℃保存；

试剂四：粉剂×1 瓶，4℃保存；临用前加入 6 mL 试剂二充分溶解；

试剂五：粉剂×1 瓶，4℃保存；临用前加入 6 mL 试剂二充分溶解；

试剂六：粉剂×1 瓶，4℃保存；临用前加入 6 mL 试剂二充分溶解；

试剂七：液体×1 瓶, 避光-20℃保存；临用前用试剂二稀释 300 倍后使用；

线粒体提取：

1、准确称取 0.1g 组织或收集 500 万细胞，加入 1mL 试剂一和 10uL 试剂三，用冰浴匀浆器或研钵匀浆。

2、将上述匀浆液于 600g（离心率），4℃离心 5min。

3、弃沉淀，将上清液移至另一离心管中，11000g，4℃离心 10min。

4、弃上清，沉淀中加入 200μL 试剂二重悬

生化检测试剂盒操作步骤：

一、‌准备工具和环境‌：确保操作台面干净、整洁，这是进行科学实验的步。杭州

‌二、‌仔细阅读说明书‌：这是使用试剂盒的基础，说明书包含了所有必要的信息和操作指南。

三、样本采集‌：按照说明书的指导，正确采集样本。不同类型的检测可能需要不同类型的样本，如血液、唾液或鼻涕等。

‌四、样本混合‌：将样本与试剂小心混合，注意轻柔操作，避免产生泡沫，以确保检测的准确性。

‌五、‌等待反应‌：混合后，耐心等待试剂盒的反应，这个时间可以用来进行其他活动，但不要着急，因为好的结果值得等待。

六、结果判读‌：时间到后，仔细判读结果。试剂盒通常会有明确的指示，告诉你如何根据显示的线条或颜色来判断结果。

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注意事项:

①加入试剂的顺序应一致,以所有反应板孔温育的时间一样。

②使用干净的塑料容器配置洗涤液。

③按照说明书中标明的时间、加液的量及顺序进行温育操作。

④底物A应挥发,避免长时间打开盖子。底物B对光敏感,避免长时间暴露于光下。避免用手接触,有毒。实验完成后应立即读取OD值。

⑤洗涤酶标板时应充分拍干,不要将吸水纸直接放入酶标反应孔中吸水。

⑥使用一次性的吸头以免交叉污染,吸取终止液和底物A、B液时,避免使用带金属部分的加样器 。

⑦实验中不用的板条应立即放回包装袋中,密封保存,以免变质。

⑧试剂应按标签说明书储存,使用前恢复到室温。稀稀过后的标准品应丢弃,不可保存。

⑨不用的其它试剂应包装好或盖好。