鸡AMP活化蛋白激酶α1(PRKAα1)ELISA试剂盒
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≥ 1盒¥2400.00
鸡AMP活化蛋白激酶α1(PRKAα1)ELISA试剂盒
ELISA:本法主要用于检测型特。该现已成为猪传染性胃肠炎(TGE)、猪伪(PR)及猪胸膜肺炎(AP)的主要检测。下面以AP2型的ELISA检测法为例介绍其操作程序:① 100μl AP2型工作量抗原包被 → 4℃过夜,洗涤三次、抛干② 用200μl缓冲液进行封闭 → 37℃ 60分钟,洗涤三次、抛干③ 加工作量1:4稀释被检猪100μl → 37℃ 60分钟,洗涤三次、抛干④ 加100μl工作量兔抗AP2型 → 37℃ 30分钟,洗涤三次、抛干⑤ 加100μl工作量猪抗兔IgG-HRP → 37℃ 60分钟,洗涤三次、抛干⑥ 加100μl OPD底物液 → 37℃ 20分钟,加终止液⑦ 用ELISA检测仪测定OD值。本试验同时设阴、阳性对照、兔抗AP2型阳性对照、空白对照。
鸡AMP活化蛋白激酶α1(PRKAα1)ELISA试剂盒
自从Engvall和Perlman(1971)报道建立酶联吸附试验(Enzyme-Linked ImmunosorbentAssays,ELISA)以来,由于ELISA具有快速、、简便、易于化等优点,使其迅速的发展和广泛应用。尽管早期的ELISA由于特不够高而妨碍了其在实际中应用的步伐,但随着的不断改进、材料的不断更新,尤其是采用基因工程制备包被抗原,采用针对某一抗原表位的单克隆进行ELISA试验,都大大了ELISA的特,加之电脑化程度的ELISA检测仪的使用,使ELISA更为简便实用和化,从而使其成为广泛应用的检测之一。如今ELISA已被广泛应用于多种和等的诊断。在动物检疫方面,ELISA在猪传染性胃肠炎、牛副结核病、牛传染性鼻气管炎、猪伪、蓝舌病等的诊断中已为广泛采用的。
试剂盒操作步骤:
实验开始前,请提前配置好所有试剂,试剂或样品稀释时,均需混匀,混匀时尽量避免起泡。每次检测都应该做曲线。如样品浓度过高时,用样品稀释液进行稀释,以使样品符合试剂盒的检测范围。
1.加样:分别设空白孔、孔、待测样品孔。空白孔加样品稀释液100μl,余孔分别加品或待测样品100μl,注意不要有气泡,加样将样品加于酶标板孔底部,尽量不触及孔壁,轻轻晃动混匀,酶标板加上盖或覆膜,37℃反应120分钟。 为实验结果有效性,每次实验请使用新的品溶液。
2.弃去,甩干,不用洗涤。每孔加生物素标记工作液 100μl(取1μl生物素标记加99μl生物素标记稀释液的比例配制,轻轻混匀,在使用小时内配制),37℃,60分钟。
3.温育60分钟后,弃去孔内,甩干,洗板3次,每次浸泡1-2分钟,350μl/每孔,甩干。
4.每孔加辣根过氧化物酶标记亲和素工作液(同生物素标记工作液) 100μl,37℃,60分钟。
5.温育60分钟后,弃去孔内,甩干,洗板5次,每次浸泡1-2分钟,350μl/每孔,甩干。
6.依序每孔加底物溶液90μl,37℃避光显色(30分钟内,此时可见品的前3-4孔有明显的梯度蓝色,后3-4孔梯度不明显,即可终止)。
7.依序每孔加终止溶液50μl,终止反应(此时蓝色立转)。终止液的加入顺序应尽量与底物液的加入顺序相同。为了实验结果的准确性,底物反应时间到后应尽快加入终止液。
8.用酶联仪在450nm波长依序测量各孔的光密度(OD值)。在加终止液后15分钟以内进行检测。
标本的采集及保存:
:全血标本请于室温放置2小时或4℃过一晚后于1000 x g离心20分钟,取上清即可检测,或将标本放于-20℃或-80℃保存,但应避免反复冻融。
:可用EDTA或肝素作为抗凝剂,标本采集后30分钟内于2 - 8° C 1000 x g离心15分钟,或将标本放于-20℃或-80℃保存,但应避免反复冻融。
细胞物上清或其它生物标本:1000 x g离心20分钟,取上清即可检测,或将标本放于-20℃或-80℃保存,但应避免反复冻融。 (注:标本溶血会影响**检测结果,因此溶血标本不宜进行此项检测。)
标本的稀释原则:通过文献检索的了解待测样本的大致含量,确定适当的稀释倍数。只有稀释至曲线的范围内,检测的结果才是准确的。稀释的中,应做好详细的记录。计算浓度时,稀释了“N”倍,标本的浓度应再乘以“N”。
品的稀释原则:2瓶,每瓶临用前以样品稀释液稀释至1ml,盖好后静置10分钟以上,然后反复颠倒/搓动以助溶解,其浓度为300 pg/ml,做系列倍比稀释后,分别稀释300 pg/ml,150 pg/ml,75 pg/ml,37.5 pg/ml,18.5 pg/ml,9 pg/ml,4.5 pg/ml,样品稀释液直接作为浓度0 pg/ml,临用前15分钟内配制。 如配制150 pg/ml品:取0.5ml(不要少于0.5ml)300 pg/ml的上述品加入含0.5ml样品稀释液的Eppendorf管中,混匀即可,其余浓度以此类推。
生物素标记的稀释原则:临用前以生物素标记稀释液稀释,稀释前根据预先计算好的每次实验所需的总量配制(每孔100μl),实际配制时应多配制0.1-0.2ml。如10μl生物素标记加990μl生物素标记稀释液的比例配制,轻轻混匀,在使用小时内配制。
辣根过氧化物酶标记亲和素的稀释原则:临用前以辣根过氧化物酶标记亲和素稀释液稀释,稀释前根据预先计算好的每次实验所需的总量配制(每孔100μl),实际配制时应多配制0.1-0.2ml。如10μl辣根过氧化物酶标记亲和素加990μl辣根过氧化物酶标记亲和素稀释液 的比例配制,轻轻混匀,在使用小时内配置
双夹心ELISA:此法与双夹心ELISA的主要区别在于:它是采用酶标抗检查多种大分子抗原,它不仅不必标记每一种,还可试验的性。此法的基本程序为:① 加(Ab-1)包被 → 4℃过夜,洗涤三次、抛干② 加待检抗原(Ag) → 37℃ 60分钟,洗涤三次、抛干③ 加用非同种动物生产的特(Ab-2)→ 37℃ 60分钟,洗涤三次、抛干④ 加入酶标抗Ab-2(AB-3)→ 37℃ 60分钟,洗涤三次、抛干⑤ 加底物液 → 37℃ 20分钟,加终止液⑥ 用ELISA检测仪测定OD值。
实验结果计算:
以物的浓度为横坐标(对数坐标),OD值为纵坐标(普通坐标),在半对数坐标纸上绘出曲线,根据样品的OD值由曲线查出相应的浓度;再乘以稀释倍数;或用物的浓度与OD值计算出曲线的直线回归方程式,将样品的OD值代入方程式,计算出样品浓度,再乘以稀释倍数,即为样品的实际浓度。
绘制曲线:在Excel工作表中,以品浓度作横坐标,对应OD值作纵坐标,绘制出品线性回归曲线,按曲线方程计算各样本浓度值。
注意事项:
1.当混合蛋白溶液时应尽量轻缓,避免起泡。
2.洗涤非常重要,不充分的洗涤易造成假阳性。
3.一次加样时间**控制在5分钟内,如标本数量多,建议使用排枪加样。
4.请每次测定的同时做曲线,做复孔。
5.如标本中待测含量过高,请先稀释后再测定,计算时请乘以稀释倍数。
6.在配制品、检测溶液工作液时,请以相应的稀释液配制,不能混淆。
7.底物请避光保存。
8.不要用其它生产厂家的试剂替换试剂盒中的试剂。
试剂盒性能
1.准确性:品线性回归与预期浓度相关系数R值,大于等于0.9900。
2.灵敏度检测浓度小于10 pg/ml。
3.特:不与其它可溶性结构类似物交叉反应。
4.重复性:批内与批见应分别小于9%和15%。