CACO-2贴壁形式细胞株技术硬

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有关实验室细胞培养基知识普及：
经典的培养基有很多种，Corning、Invitrogen(GIBCO)、Thermo Fisher(HyClone)等公司都可以提供。其中DMEM、RPMI 1640、MEM、DMEM/F12都是应用广泛的培养基。其他如M199、IMDM、L15培养基等也用于某些细胞的培养。
MEM是由Eagle’s基础培养基(BME)发展而来的，其中增加了组分的范围及浓度。
BEM(DMEM)培养基是为小鼠成纤维细胞设计的，现在常用于贴壁细胞的培养。DMEM的氨基酸浓度是MEM的两倍，维生素浓度是MEM的4倍，采用双倍的HCO3-和CO2浓度起到更好的缓冲作用。初的配方中葡萄糖含量为1000 mg/L，后来为了某些细胞的生长需要，将葡萄糖含量又调整为4500 mg/L，这就是大家常说的低糖和高糖了。
aMEM含有附加的氨基酸、维生素以及核苷和脂肪酸，它可广泛应用于各种细胞类型，包括对营养成分要求苛刻的细胞。
Ham’s F12是为在低血清浓度下克隆CHO细胞而设计的，现在也广泛应用于克隆形成率的分析及原代培养。F12还可以与DMEM等体积混合使用，得到一种高浓度与成分多样化相结合的产物，这种培养基已应用于许多原代培养及更难养的细胞系的培养。
RPMI 1640培养基是专为淋巴细胞培养而设计的，现在已广泛应用于悬浮细胞的培养。
干粉培养基：以前大部分实验室都是用干粉培养基，但配制过程就较为繁琐，要溶解、调pH值，过滤，过程中可能会产生一些浓度误差，而且有些实验室的水质并不理想，所以培养的效果会有差异。如果使用液体培养基，这种人为的误差会减少，因为毕竟是大批量工业化生产的，批间差会很小。大家是不是感觉液体培养基会贵很多，以前是这样，但现在大家都认同了。
无血清培养基(Serum-Free Media)，通常以SFM表示，顾名思义，就是在细胞培养中不需要添加血清，但是在某些应用中可能要添加生长因子或细胞因子。无血清培养基中添加了血清的主要成分：粘附因子、生长因子、必需的营养物质和激素等，能减少上述血清带来的不利因素，使细胞培养的条件更稳定。但它也不是的，从有血清培养过渡到无血清培养的条件并不像想象中那么直截了当。处于发育的不同分化阶段的细胞(例如干细胞与定向前体细胞相比)需要不同的配方，对生长因子和细胞因子的选择尤为重要。而且在去除血清的同时，也去除了一些血清蛋白具有的保护、作用，因此对试剂、水的纯度和仪器清洁度的要求更高。另外，它的价格也比普通的培养基贵很多。" "

造成实验室细胞污染常见情况总结：
细胞培养中常见污染的是细菌、真菌和支原体污染。细胞一旦污染，大多数较难处理。那么，哪些情况我们不注意的话就会造成细胞污染呢？我们根据常见细胞培养实验分析总结下。
违规操作：1. 为节省时间，有人已经用超净台四个多小时，不开紫外灭菌30min,酒精擦拭后直接开始试验。2. 器材或者溶液很久没用，未检测是否污染而直接使用；离心管多次使用，枪头为了方便交叉使用。3. 超净台不点酒精灯；点了酒精灯放在右上角，而你在左下角做试验。4. 不带手套，徒手操作。5. 细胞培养间配备枪式移液器、手术器械、离心机、冰箱等仪器设备以及的实验服和拖鞋，未定期消毒。物品被带出细胞房使用。培养细胞过程中使用的所有实验用具，如移液管、一次性枪头、一次性塑料离心管、冻存管等未按要求灭菌使用（通常需121°C高压灭菌20分钟后37％烤干备用）。
超净台和桌面，东西太多太乱：超净台不是储物箱，什么培养皿、各种规格的板子、枪头就不要堆在超净台！这样就会有许多紫外线顾不到的卫生死角。细胞房其他的桌面，切忌东西堆积如山，不要将酒精棉球、标签纸、牛皮纸买来后全部堆在细胞房！一不小心“飘”进你的细胞培养板里，细胞就会养的不好，啥时候死了都不知道！
培养箱太久没清洁：细胞污染了，并非直接扔了培养皿就不管了，你还得看看这个恒温培养箱里其他培养皿或孔板里的细胞是否污染，如果有而且好几个板子都有类似的污染块，那很可能是培养箱中的水或者空气污染了，得给培养箱做个大扫除，重新酒精消毒，照紫外；孵箱里的水，水没了要记得加，还得记得十天半个月的就用酒精擦擦托盘。
细胞房人多口杂，难管理：在细胞房这种卫生要求高，人多了，不确定因素多了，难以试验在无菌条件下操作。出入试验室，实验服当风衣穿，不扣纽扣，不戴鞋套，就容易造成细胞污染；超净台做实验时，喜欢说话聊着做试验，要是还不带口罩，里面就有很多细菌等着去攻击你的细胞呢！" "

细胞冻存及复苏基本知识普及：
细胞冻存是细胞保存的主要方法之一。利用冻存技术将细胞置于-196℃液氮中低温保存，可以使细胞暂时脱离生长状态而将其细胞特性保存起来，这样在需要的时候再复苏细胞用于实验。而且适度地保存一定量的细胞，可以防止因正在培养的细胞被污染或其他意外事件而使细胞丢种，起到了细胞保种的作用。
除此之外，还可以利用细胞冻存的形式来购买、寄赠、交换和运送某些细胞。细胞冻存时向培养基中加入保护剂--终浓度5%.15%的甘油或二甲基亚砜(DMSO)，可使溶液冰点降低，加之在缓慢冻结条件下，细胞内水分透出，减少了冰晶形成，从而避免细胞损伤。
采用""慢冻快融""的方法能较好地细胞存活。标准冷冻速度开始为-1 到 -2℃/min，当温度低于-25℃时可加速，到-80℃之后可直接投入液氮内(-196℃)。
细胞冻存的步骤
（1）选择处于对数生长期的细胞，在冻存天好换液。将多个培养瓶中的细胞培养液去掉，用0.25% 胰蛋白酶消化。适时去掉胰蛋白酶，加入少量新培养液。用吸管吸取培养液反复吹打瓶壁上的细胞，使其成为均匀分散的细胞悬液。悬浮生产细胞则不要消化处理。然后将细胞收集于离心管中离心(1000r/min，10分钟)。
（2）去上清液，加入含20%小牛血清的完全培养基，于4℃预冷15分钟后，逐滴加入已无菌的DMSO或甘油，用吸管轻轻吹打使细胞均匀，细胞浓度为5×106～1×107/mL之间。（冻存培养液的配置是不是一定要用小牛血清呢？答案是不一定的，具体要看培养的细胞类型来选择。
（3）将分装上述细胞悬液于2ml冻存管中，每管0.25ml。冻存管要将盖子盖紧，并标记好细胞名称和冻存日期，同时作好登记（日期、细胞种类及代次、冻存支数）
（4）将装好细胞的冻存管放到冻存盒中，-80℃冰箱过夜。；如果有程序降温器(放在-80℃冰箱过夜，放入液氮罐)好;或者可以在4℃，2h;然后转到-20℃，2h;-80℃，2h;放入液氮罐。
（5）细胞冻存在液氮中可以长期保存，但为妥善起见，冻存半年后，好取出一只冻存管细胞复苏培养，观察生长情况，然后再继续冻存。
如何进行细胞复苏：
1. 从液氮容器中取出冻存管，直接浸入37℃温水中，并不时摇动令其尽快融化。
2. 从37℃水浴中取出冻存管，打开盖子，用吸管吸出细胞悬液，加到离心管并滴加10倍以上培养液，混匀;
3. 离心， 1000rpm，5min;
4. 弃去上清液，加入含10%小牛血清培养液重悬细胞，计数，调整细胞密度，接种培养瓶，37℃培养箱静置培养;
5. 次日更换一次培养液，继续培养。
温馨提醒
1.从增殖期到形成致密的单层细胞以前的培养细胞都可以用于冻存，但好为对数生长期细胞。在冻存天好换一次培养液;
2.将冻存管放入液氮容器或从中取出时，要做好防护工作（戴棉手套），以免冻伤;
3.冻存和复苏好用新配制的培养液。
细胞复苏的时候，有些初次实验员将冻存管从液氮中取出后，放在室温下，经常发生冻存管爆炸，该怎么避免出现这种情况吗？其中在拧紧冻存管的时候是否有哪些细节要注意的？
一般常用的方法是取出冻存管后在超净工作台中用酒精棉球擦试管口，再稍拧松盖子，再放37度水浴锅中摇溶，在将细胞转移到装有37度预热过的培养基的试管中，迅速离心，再用培养基洗一遍。" "

ACC-29 MOLT-16传代性细胞株
ACC-30 JOSK-M传代性细胞株
ACC-33 VERO-B4传代性细胞株
ACC-34 P12-ICHIKAWA传代性细胞株
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ACC-56 R1传代性细胞株
ACC-57 HELA传代性细胞株"