小鼠乙酰辅酶A(A-CoA)ELISA试剂盒

酶联吸附实验 (ELISA) 是一种定性或定量检测,使用抗体来结合并测定目的分子。与其他检测相似,可使用单克隆抗体和多克隆抗体来检测分析物(如肽、蛋白、抗体和小分子)。抗体对分析物产生特异性,并且一部分(如辣根过氧化物酶 [HRP])直接或间接偶联抗体,从而提供检测方法并实现可能的信号放大。通过多种ELISA方法和检测化学成份,可以让终端用户调整适当的检测,以解决预计的实验问题。该方法可以用于单份样品检测或高通量筛选。

小鼠乙酰辅酶A(A-CoA) ELISA 试剂盒

直接 ELISA

在直接 ELISA 中,抗原直接结合微孔板表面,随后添加直接偶联的抗体来结合/检测。简而言之,实验步骤的 步便是将抗原固定在微孔板上。 步是添加一种封闭试剂,防止检测抗体出现非特异性结合。接下来,添加直接偶联某种酶(如 HRP)的检测抗体。该检测抗体将结合抗原,并且剩余的抗体会从孔中洗掉。随后添加这种酶的底物,短暂孵育后,通常在一个读板机上测定每个孔的信号。直接 ELISA 的实验步骤有限,可让实验设置整体简化。

直接法优缺点:

优点:1:快速,仅使用一种抗体且步骤较少;2:消除了 抗体的交叉反应性。

缺点:1:一抗的反应性可能受到酶或标签标记的不利影响;2:为每个特定的ELISA系统标记一抗,既费时又昂贵;3:由于标记的抗体密度较低导致较低的灵敏度;4:抗原的固定化不是特异性的,有较高背景干扰。

小鼠乙酰辅酶A(A-CoA) ELISA 试剂盒

间接 ELISA

间接 ELISA 类似于直接 ELISA;但主要的差别在于会通过 偶联抗体来检测结合抗体。实验步骤的 步便是将抗原固定在微孔板上。 步是添加一种封闭试剂,防止结合抗体出现非特异性结合。第三,添加一种抗原特异性结合抗体,短暂孵育后,用缓冲液洗涤板孔,以去除多余的试剂。下一步是“间接”检测,其中添加一种抗体来检测 结合抗体。这种抗体通常偶联某种酶。在孵育和洗涤板孔之后,添加该酶的底物。随后,短暂孵育后,通常在一个读板机上测定每个孔的信号。 抗体通常是一种抗物种抗体。间接 ELISA 的主要优势在于可以使用偶联的 抗体来进行多个实验,前提是在所有不同的实验中使用相同物种的结合抗体。另一个优势是 抗体会放大信号,因为大约 2 个抗体将结合 抗体。随着步骤数量的增加,实验步骤通常会耗时更长,并且更容易出错。此外,背景信号可能会增强,因为所需的试剂数量更多,每一种都可能会出现非特异性结合。

间接法优缺点:

优点:1:可以在一个物种中制备许多一抗,并且可以将相同的标记二抗用于检测;2:由于没有标记,保留了 抗体的 反应性;3:高标记的二抗密度可实现高灵敏度,从而导致信号放大。

缺点:1:二抗可能会发生交叉反应,从而导致非特异性信号;2:这个过程中需要一个额外的孵育步骤

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竞争性ELISA

竞争性/抑制性 ELISA 也称封闭 ELISA,它对干扰预计信号的程度进行定量,以测定分析物的数量。这样做的一个方法是用一种对靶标有特异性的抗体包被平板。靶标可以偶联某种酶,并用于检测。如果实验含有次于 量的检测靶标,则高浓度的未标记靶标会竞争性地结合,从而减弱信号。这类竞争性实验可用来测定某种特异性分析物的水平。

竞争法优缺点:

优点:1:灵敏度高以及灵活性高;2:能测定微量的分析物。

缺点:1:特异性较低;2:需要酶标记的抗原。

<p font-size:14px;"="" style="padding: 0px;margin-top: 0px;margin-bottom: 0px;list-style: none;font-family: 'Microsoft YaHei';font-size: 14px;white-space: normal">操作步骤
实验开始前,请提前配置好所有试剂,试剂或样品稀释时,均需混匀,混匀时尽量避免起泡。每次检测都应该做标准曲线。如样品浓度过高时,用样品稀释液进行稀释,以使样品符合试剂盒的检测范围。
1.加样:分别设空白孔、标准孔、待测样品孔。空白孔加样品稀释液100μl,余孔分别加标准品或待测样品100μl,注意不要有气泡,加样将样品加于酶标板孔底部,尽量不触及孔壁,轻轻晃动混匀,酶标板加上盖或覆膜,37℃反应120分钟。
为实验结果有效性,每次实验请使用新的标准品溶液。
2.弃去液体,甩干,不用洗涤。每孔加生物素标记抗体工作液 100μl(取1μl生物素标记抗体加99μl生物素标记抗体稀释液的比例配制,轻轻混匀,在使用小时内配制),37℃,60分钟。
3.温育60分钟后,弃去孔内液体,甩干,洗板3次,每次浸泡1-2分钟,350μl/每孔,甩干。
4.每孔加辣根过氧化物酶标记亲和素工作液(同生物素标记抗体工作液) 100μl,37℃,60分钟。
5.温育60分钟后,弃去孔内液体,甩干,洗板5次,每次浸泡1-2分钟,350μl/每孔,甩干。
6.依序每孔加底物溶液90μl,37℃避光显色(30分钟内,此时肉眼可见标准品的前3-4孔有明显的梯度蓝色,后3-4孔梯度不明显,即可终止)。
7.依序每孔加终止溶液50μl,终止反应(此时蓝色立转黄色)。终止液的加入顺序应尽量与底物液的加入顺序相同。为了实验结果的准确性,底物反应时间到后应尽快加入终止液。
8.用酶联仪在450nm波长依序测量各孔的光密度(OD值)。 在加终止液后15分钟以内进行检测。
注:
1. 用户在初次使用试剂盒时,应将各种试剂管离心数分钟,以便试剂集中到管底。
2. 每次实验留一孔作为空白调零孔,该孔不加任何试剂,只是 加底物溶液及2N H2SO4。测量时先用此孔调OD值至零。
3. 为防止样品蒸发,试验时将反应板放于铺有湿布的密闭盒内,酶标板加上盖或覆膜。
4. 未使用完的酶标板或者试剂,请于2-8℃保存。标准品、生物素标记抗体工作液、辣根过氧化物酶标记亲和素工作液请依据所需的量配置使用。请勿重复使用已稀释过的标准品、生物素标记抗体工作液或、辣根过氧化物酶标记亲和素工作液。
5. 建议检测样品时均设双孔测定,以检测结果的准确性。
洗板方法
手工洗板方法:吸去(不可触及板壁)或甩掉酶标板内的液体;在实验台上铺垫几层吸水纸,酶标板朝下用力拍几次;将推荐的洗涤缓冲液至少0.3ml注入孔内,浸泡1-2分钟。根据需要,重复此过程数次。
自动洗板:如果有自动洗板机,应在熟练使用后再用到正式实验过程中。